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Revisão
Aspectos celulares e moleculares da inflamação
Danilo Mesquita Jr., Júlio A. Pereira Araújo
Reumatologistas
Tânia Tieko Takao Catelan, Alexandre Wagner Silva de Souza, Neusa Pereira da Silva, Luis Eduardo C. Andrade
Reumatologistas
Wilson de Melo Cruvinel
Prof. Assistente de Imunologia dos cursos de Biomedicina e Medicina, Diretor do Departamento de Biomedicina da PUC-Goiás

Numeração de páginas na revista impressa: 66 à 81

Introdução

A primeira defesa do organismo a um dano tecidual é a resposta inflamatória. A inflamação é um processo biológico complexo que envolve componentes vasculares, celulares e uma diversidade de substâncias solúveis, apresentando como sinais clínicos característicos rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional. A finalidade do processo inflamatório é remover o estímulo lesivo e iniciar a recuperação tecidual local.
Durante a inflamação vários sistemas bioquímicos, como o sistema do complemento e da coagulação, são ativados auxiliando no estabelecimento, evolução e resolução do processo. Adicionalmente, várias substâncias solúveis de meia vida curta são liberadas, exercem sua ação e são degradadas no sítio inflamatório. Em geral, o sucesso na remoção do estímulo lesivo leva à conclusão do processo e término da resposta aguda, ensejando o processo de reparo tecidual completo. Nesse processo predominam elementos da resposta imune inata, mas podem participar também linfócitos, plasmócitos e anticorpos. Na inflamação crônica, em geral ocasionada por persistência do estímulo nóxico, o processo inflamatório se mantém e sofre alterações qualitativas, caracterizadas por mudança progressiva nos elementos celulares e solúveis que infiltram o tecido. Ocorre maior envolvimento da imunidade adquirida, de células imunocompetentes, macrófagos e fibroblastos. Aumentam as probabilidades de que a reconstituição não seja completa.

A resposta inflamatória aguda evolui a partir de uma fase vascular que tem início imediatamente após o dano e envolve basicamente a microcirculação. Em condições basais apenas uma fração dos capilares que compõem a rede tecidual estão pérvios, entretanto após uma agressão ocorre vasodilatação local e recrutamento da maioria dos capilares da rede, seguida de aumento da permeabilidade capilar. O aumento imediato da perfusão tecidual e da permeabilidade é mediado por aminas vasoativas, histamina e serotonina, que são liberadas por mastócitos e monócitos minutos após a agressão. Inicialmente, saem do leito capilar eletrólitos e pequenas moléculas, constituindo o transudato posteriormente saem também moléculas maiores como albumina e fibrinogênio, constituindo um exsudato. A saída de proteínas para o espaço extravascular é acompanhada de saída de água, levando à marginalização dos leucócitos, que passam a circular junto ao endotélio. Concomitantemente, o endotélio local torna-se ativado e os endoteliócitos passam a expressar moléculas de superfície que colaboram para a maior aderência dos leucócitos e eventual migração destes para os tecidos. Saem também para o espaço extravascular e são ativados componentes do sistema do complemento, do sistema gerador de cininas e do sistema da coagulação. Macrófagos residentes no tecido lesado liberam citocinas inflamatórias como IL-1, TNF-a e quimiocinas.

A migração de células circulantes para os tecidos, denominada diapedese, é direcionada pela presença de um gradiente de substâncias quimiotáticas no sítio inflamatório. No tecido, as células buscam remover o patógeno por meio de sua capacidade fagocitária, permitindo o reparo da lesão. Na inflamação aguda as principais células são os neutrófilos e os macrófagos. A permanência do agente lesivo leva à cronificação do processo inflamatório, sendo observada concomitância de destruição e reparo tecidual. Na inflamação crônica o tecido apresenta caracteristicamente um infiltrado constituído por células mononucleares (monócitos, macrófagos e linfócitos), sinais de angiogênese e fibrose (Quadro 1). Os estímulos persistentes que induzem a cronificação do processo inflamatório podem ser de diversas naturezas, tais como bactérias intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, substâncias químicas como a sílica, e mesmo agentes físicos, como a radiação ultravioleta e traumas repetitivos. Nas doenças ditas auto-imunes, como a artrite reumatóide, não se conhece a causa da cronificação do processo inflamatório.



Migração dos leucócitos: moléculas de adesão

Em condições normais de fluxo sangüíneo, as células se concentram no centro do vaso onde há menos resistência com a parede vascular e a velocidade do fluxo é maior. Quando há dilatação do vaso a velocidade do fluxo sangüíneo diminui, a quantidade de células aumenta e as células colidem mais freqüentemente com as células endoteliais ativadas que expressam moléculas de superfície capazes de ligar aos leucócitos. De modo geral, as células endoteliais são adaptadas a expressar altos níveis de moléculas de adesão da família das inas (ina E e ina P), molécula 1 de adesão intercelular (ICAM-1) e molécula 1 de adesão da célula vascular (VCAM-1). A expressão dessas moléculas é resultado do processo de ativação do endotélio que ocorre em condições de lesão tecidual, na presença de subprodutos de microrganismos (e.g., lipopolissacáride - LPS) ou mediante contato com fatores provenientes da resposta inflamatória como componentes das cascatas do complemento, coagulação, citocinas (IL-1, TNF-a) e mediadores como a histamina e o leucotrieno B4.

As integrinas são proteínas heterodiméricas, compostas por uma cadeia a e uma cadeia b, localizadas na superfície celular, mediadoras da adesão entre leucócitos e células endoteliais, bem como entre leucócitos e as proteínas da matriz extracelular. A ligação da integrina a seu ligante é primordial para que ocorra a migração dos leucócitos para os tecidos e a afinidade dessa ligação é regulada por diversos estímulos. As integrinas expressam uma cadeia b conservada (b1 ou CD29 e b2 ou CD18) associada a uma cadeia a variável. As combinações das diferentes cadeias a e b produzem dímeros com distintas propriedades de ligação e que se expressam em diferentes tipos celulares. As integrinas leucocitárias interagem por meio de adesão forte às moléculas de adesão intercelular (ICAMs), presentes no endotélio ativado. Estas últimas por sua vez são caracterizadas por domínios extracelulares relacionados à família das imunoglobulinas e induzidas no endotélio ativado (ICAM-1, VCAM-1), no endotélio em repouso (ICAM-2) e nos leucócitos ativados (PECAM). Na Figura 1a estão esquematizadas algumas moléculas de adesão e os respectivos ligantes.

A dinâmica de produção das moléculas de adesão varia de minutos a horas. Algumas moléculas encontram-se no citosol sobre a membrana de vesículas secretórias intracitoplasmáticas (corpos de Weibel-Palade) que rapidamente se fundem à membrana plasmática quando a célula é estimulada como no caso da ina P. Outras moléculas, como a ina E, ICAM-1 e VCAM-1, demandam estimulação de horas para sua síntese. Tomando como exemplo um neutrófilo, o primeiro contato das células com o endotélio ativado é mediado pela interação das inas P e E no endotélio à mucina presente na superfície do granulócito. Concomitantemente, a ina L de expressão constitutiva nos neutrófilos liga-se ao conjunto de mucinas na superfície do endotélio. Essas ligações são de dissociação rápida, fazendo com que os neutrófilos rolem na parede do vaso impelidos pelo fluxo sangüíneo (Figura 1b). O contato das células com a parede endotelial aumenta a exposição dos leucócitos aos fatores quimiotáticos presentes no endotélio ativado ou às quimiocinas que se difundem no sangue a partir do tecido lesado. Deste modo ocorre estímulo adicional que promove a movimentação celular intermediado por mediadores, de baixo peso molecular, quimicamente atraentes para os leucócitos. Entre os fatores quimiotáticos destacam-se fragmentos de fibrina, colágeno, fatores solúveis plaquetários, mediadores dos mastócitos, subprodutos do complemento (C5a, C3a e C4a), resíduos do metabolismo bacteriano como os peptídeos n-formilados, entre outros. São também importantes as quimiocinas, grupo de citocinas secretadas por diferentes tipos celulares e responsáveis por direcionar as células para o foco inflamatório.


Figura 1 - Migração dos leucócitos para o sítio inflamatório. Os macrófagos, estimulados pelos indutores da resposta inflamatória produzem citocinas como TNF e IL-1, as quais ativam as células endoteliais das vênulas a expressarem inas, ligantes para integrinas e quimiocitocinas. As inas mediam a adesão fraca dos neutrófilos, as integrinas, a adesão forte e as quimiocinas ativam e estimulam a migração dos neutrófilos para o foco inflamatório. Os monócitos e linfócitos T ativados usam os mesmos mecanismos para migrar para os locais de infecção.



A ativação mediada pelas quimiocinas induz alterações nas configurações das integrinas sobre a superfície dos leucócitos permitindo a ligação aos ligantes expressos no endotélio e gerando interações estáveis e prolongadas que imobilizam os neutrófilos e promovem sua aderência à parede do vaso. Conseqüentemente ocorre a migração das células aderidas para o tecido adjacente a partir de movimentos ativos, direcionada pelo gradiente crescente de produtos quimiotáticos e facilitada pela interação das integrinas aos componentes da matriz extracelular como a fibrina e a fibronectina. A etapa de extravasamento e migração leucocitária é dependente da ação das quimiocinas como, por exemplo, IL-8 e MCP-1, que são produzidas nos locais de infecção e se ligam aos proteoglicanos na matriz extracelular e em moléculas similares na superfície das células endoteliais. A IL-8 é liberada por macrófagos ativados e atrai neutrófilos que são estimulados a penetrar no tecido inflamado, ao passo que MCP-1 recruta monócitos, células T, NK e células dendríticas mais tardiamente. Uma vez no foco inflamatório, os macrófagos e neutrófilos reconhecem o elemento indutor do processo inflamatório e, no caso de serem microrganismos, realizam fagocitose e são ativados para posterior destruição dos patógenos englobados.

Mediadores da resposta inflamatória

Os mediadores da resposta inflamatória são variados e derivam tanto de precursores plasmáticos quanto de células, incluindo produtos de clivagem de precursores, produtos de cascatas de ativação, substâncias pré-formadas, radicais livres de oxigênio, óxido nítrico e derivados do ácido araquidônico (Quadros 2 e 3).
A histamina exerce os seus efeitos fisiológicos mediante interação com três diferentes tipos de receptores da célula-alvo, H1, H2 e H3. H1 promove a contração da musculatura lisa de vários órgãos e aumento da permeabilidade dos capilares venosos (drogas genericamente conhecidas como anti-histamínicas bloqueiam estes receptores). H2 aumenta a secreção de ácido gástrico e de muco nas vias aéreas e H3 afeta principalmente a síntese de histamina e sua liberação por mastócitos e basófilos.

A bradicinina faz parte da família de peptídeos gerados no plasma por ação de enzimas em substratos chamados cininogênios. Os receptores B2 são constitutivos e medeiam o aumento da permeabilidade e do fluxo sangüíneo, broncoconstrição e estimulação de receptores algésicos. Os receptores B1 são pouco expressos na maioria dos tecidos em condições normais, mas são rapidamente induzidos em condições patológicas por vários estímulos pró-inflamatórios, como as citocinas IL-1, IFN-g e TNF-a.

Outro grupo de moléculas importantes no processo inflamatório são os neuropeptídios, substância P, neurocinina A, VIP (vasoactive intestinal peptide), CGRP (calcitonin gene-related peptide), somatostanina e encefalinas. A substância P e o CGRP têm efeitos pró-inflamatórios e são responsáveis pela inflamação neurogênica. A substância P e as neurocininas atuam nos receptores NK1, aumentando o fluxo sangüíneo e a permeabilidade vascular, e em receptores NK2, induzindo broncoconstrição.


Os mediadores lipídicos derivados do ácido araquidônico são produzidos como conseqüência da ativação de fosfolipases que clivam os fosfolípides constituintes da membrana celular, gerando as prostaglandinas, leucotrienos e PAF (platelet activating factor). As prostaglandinas têm funções inflamatórias, induzindo febre, hiperalgesia e vasodilatação. Ademais contribuem para contração ou relaxamento da musculatura lisa e potencialização de edema. Também atuam em processos fisiológicos como na manutenção da integridade do epitélio das mucosas, manutenção da função renal, reprodução (sobrevivência do feto, implante de ovo, contração do útero durante o parto) e do crescimento e da morte celular.

A inflamação fornece sinais que são fundamentais para que os linfócitos sejam ativados iniciando a resposta imune específica e formando assim um elo de ligação entre a imunidade inata e adquirida.

Quimiocinas

As quimiocinas constituem uma grande família de citocinas estruturalmente homólogas, responsáveis pela movimentação dos leucócitos, incluindo sua migração para locais de inflamação tecidual, a partir do sangue. São pequenos polipeptídios de 8 a 12 kDa que contêm duas pontes dissulfeto internas. Cerca de 50 quimiocinas diferentes já foram identificadas, sendo classificadas em famílias com base no número e localização dos resíduos de cisteína N-terminais. As duas principais famílias são a das quimiocinas CC, nas quais resíduos de cisteína são adjacentes, e a família CXC, na qual esses resíduos são separados por um aminoácido, como, por exemplo, a IL-8.

As quimiocinas podem ser constitutivas ou induzidas. As constitutivas são produzidas normalmente em vários tecidos e recrutam leucócitos, principalmente linfócitos, para esses tecidos na ausência de inflamação. As quimiocinas induzidas (ou inflamatórias) são produzidas por várias células em resposta a estímulos inflamatórios e recrutam leucócitos para locais de inflamação.

Os receptores das quimiocinas são receptores acoplados a proteína G com sete domínios transmembrana presentes na superfície celular. Já foram identificados 11 receptores diferentes para quimiocinas CC (CCR1 a CCR11) e 7 para quimiocinas CXC (CXCR1 a CXCR7). Os receptores de quimiocinas podem ser específicos para determinadas quimiocinas (e.g., CCR9, CXCR6), mas, comumente, um mesmo receptor pode ligar várias quimiocinas do mesmo grupo.

Ações biológicas das quimiocinas
Inicialmente estudadas devido ao seu importante papel nos processos inflamatórios, sabe-se atualmente que as quimiocinas desempenham papel crucial na movimentação das células mononucleares pelo corpo e sua migração para os tecidos, contribuindo na resposta imune adaptativa e/ou na patogênese de várias doenças. Os receptores de quimiocinas são expressos em leucócitos, células dendríticas e células de Langerhans. A maior variedade de receptores é observada em linfócitos T e sua expressão pode definir subtipos de linfócitos T. A ligação entre quimiocinas e receptores inicia uma complexa cascata de sinalização que gera respostas quimiotáticas, degranulação, liberação de espécies reativas e alteração na afinidade das integrinas presentes na superfície celular.

Além das funções como agente quimiotático de leucócitos, os estudos com as quimiocinas e seus receptores estão revelando outros importantes papéis para estas moléculas. Alguns receptores de quimiocinas, entre eles o CCR5, são os principais co-receptores para certas cepas do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Têm sido identificados polimorfismos em genes que codificam as quimiocinas, o que poderia interferir na sua função. Por exemplo, a deleção de 32 nucleotídeos na variante polimórfica CCR532 torna os seus portadores resistentes à infecção pelo HIV.

Algumas quimiocinas estão envolvidas na angiogênese por seu efeito quimiotático sobre células endoteliais, enquanto outras exercem um efeito antiangiogênico. Acredita-se que as quimiocinas também desempenhem papel importante na hematopoiese. Quimiocinas têm sido relacionadas ao desenvolvimento de metástases tumorais e, contraditoriamente, à inibição do crescimento de células tumorais, bem como a infecções e doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide e a esclerose múltipla. Níveis elevados de CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1b, CCL5/RANTES e CXCL10/IP-10 têm sido encontrados no sistema nervoso central de pacientes com esclerose múltipla e em modelos experimentais desta doença. Em um trabalho recente, pacientes com esclerose múltipla ativa apresentaram níveis elevados de CXCL10/IP-10 no líquor, enquanto os níveis de CCL2/MCP-1 foram significativamente menores quando comparados a controles assintomáticos. Níveis elevados de IL-8 têm sido relatados em várias condições inflamatórias sistêmicas como a sarcoidose e a sepse. Níveis teciduais aumentados de IL-8 e anticorpos séricos contra esta quimiocina parecem estar elevados na colite ulcerativa em atividade. Foi observada elevada expressão de quimiocinas em biópsias de glândulas salivares menores de pacientes com síndrome de Sjögren.

Neutrófilos

Os granulócitos neutrófilos, ou células polimorfonucleares, são as células circulantes mais abundantes do sistema imune e atuam nas fases precoces da resposta inflamatória. Durante um processo inflamatório os neutrófilos são uma das primeiras células a deixar a vasculatura e migrar para o tecido, atraídos por quimiocinas e mediadores inflamatórios como IL-8 e INF-g liberados pelas células endoteliais ativadas, macrófagos e mastócitos, e pelos produtos C3a e C5a do complemento. A migração é orientada pelo gradiente de concentração de mediadores (mecanismo denominado quimiotaxia) que são reconhecidos por receptores de superfície dos neutrófilos. Esta interação favorece o deslocamento dos neutrófilos pela matriz extracelular e sua rápida chegada ao sítio inflamatório. Durante a fase aguda da inflamação, principalmente em casos de infecção bacteriana, além do rápido recrutamento de neutrófilos para o sítio inflamatório há também grande aumento na sua produção. Os neutrófilos podem alcançar o sítio inflamatório em cerca de uma hora após a lesão tecidual e são os principais componentes do pus (o que dá sua característica branco-amarelada).

A capacidade fagocitária dos neutrófilos é estimulada por receptores Toll-like, que reconhecem padrões moleculares associados com patógenos (PAMPs) presentes na superfície dos microrganismos, receptores para opsoninas, receptores para Fc de IgG e receptores para C3b. O microrganismo ou partícula estranha fagocitada é mantido dentro de um vacúolo denominado fagossomo que se funde com uma vesícula denominada lisossomo, rica em enzimas proteolíticas e oxidativas que conferem aos fagócitos sua capacidade microbicida. A fusão do fagossomo com o lisossomo resulta no fagolisossomo onde se dá a destruição do microrganismo. O chamado sistema de oxidase dos fagócitos é composto por múltiplas subunidades enzimáticas, muitas das quais presentes na membrana fagolisossomal de fagócitos ativados e sua função é reduzir o oxigênio molecular a intermediários reativos do oxigênio, que são bastante tóxicos para bactérias. A deficiência em componentes desse sistema de membrana ocasiona deficiência grave na capacidade de destruição de determinadas bactérias pelos fagócitos, sendo responsável por uma importante imunodeficiência primária denominada doença granulomatosa crônica.

Outra via de ação neutrofílica é mediada por grânulos secretados no meio extracelular, pelo processo de degranulação. Existem três classes de grânulos liberados por estas células:

1. Grânulos primários: também conhecidos como grânulos azurófilos, contêm mediadores importantes no combate bacteriano geral, como a mieloperoxidase, defensinas, elastase neutrofílica, proteína de aumento da permeabilidade bacteriana e as catepsinas G
2. Grânulos secundários: apresentam componentes secretados especificamente por neutrófilos, sendo a lactoferrina o principal exemplo
3. Grânulos terciários: as principais proteínas secretadas são as catepsinas e as gelatinases.
Além da liberação de fatores antimicrobianos no meio extracelular, estudos recentes mostram que os neutrófilos podem gerar fibras extracelulares, também chamadas de “armadilhas extracelulares neutrofílicas” (NETs). As NETs são formadas por componentes dos grânulos e componentes nucleares que “desarmam” (anulam fatores de virulência) e destroem bactérias extracelulares (Figura 2). Diversos estudos indicam que as NETs estão presentes em grande quantidade em sítios inflamatórios e, além de atuarem ativamente sobre os microrganismos, servem também como uma barreira física que impede sua disseminação.


Figura 2 - Imagem de microscopia eletrônica, mostrando as NETs atuando sobre bactérias e cortes ultrafinos, mostrando neutrófilos liberando as NETs ao seu redor (Volker Brinkmann et al., 2004).

Macrófagos

São células teciduais originadas de uma população específica de células sangüíneas denominadas monócitos. Os monócitos e os macrófagos são células fagocíticas eficientes, capazes de engolfar e ingerir patógenos e debris celulares. Fazem parte do repertório de defesa da imunidade inata, mas atuam também como indutores da reposta adaptativa, pois após a fagocitose podem processar e apresentar antígenos via moléculas de MHC, estimulando assim a resposta mediada por células T.

Os monócitos sangüíneos, assim como os neutrófilos, podem ser recrutados para sítios inflamatórios. Após migrar do meio intravascular para o tecido eles se diferenciam em macrófagos, sendo atraídos por mediadores inflamatórios pelo mecanismo de quimiotaxia. Ao contrário dos neutrófilos, que possuem meia vida curta, os macrófagos podem permanecer no tecido por meses a anos, atuando como verdadeiras sentinelas desses locais. Na vigência de invasão microbiana ou dano tecidual serão, juntamente com as células dendrídicas e os linfócitos T gd, uma das primeiras categorias de células a reconhecer e apresentar o antígeno às células da resposta imune adaptativa.
Outra função importante exercida pelos macrófagos é a remoção de debris necróticos. A remoção de resíduos celulares é fundamental para manutenção da homeostasia na inflamação crônica, pois o primeiro estágio da inflamação é dominado por granulócitos neutrófilos, muitos dos quais são ingeridos por macrófagos quando mortos ou envelhecidos. Este mecanismo de fagocitose é dependente da expressão da molécula CD31 (PECAM-1). O processo de remoção de restos necróticos é realizado pelos chamados ”macrófagos da limpeza”, que irão se localizar em regiões estratégicas, como pulmão, fígado, tecido neural, osso, baço e tecido conjuntivo. Nestes locais os macrófagos vão atuar ativamente na defesa e manutenção da homeostase local.

Os macrófagos são células capazes de exercer funções diversas. Além de participarem dos mecanismos de limpeza, atuam ativamente como células apresentadoras de antígenos durante um processo inflamatório. Também potencializam as repostas de células T e B via expressão de moléculas co-estimulatórias e liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL -1, IL-6, IL-12 e TNF-a, bem como outras citocinas e quimiocinas importantes (Figura 3). Os macrófagos possuem uma maquinaria de digestão intracelular muito potente, mediada tanto pelos intermediários reativos do oxigênio, como pelos intermediários reativos do nitrogênio. Os intermediários reativos do nitrogênio têm como principal representante o óxido nítrico (NO), que é produzido por ação da enzima chamada sintetase do óxido nítrico indutível. Esta enzima não é encontrada em macrófagos em repouso, mas pode ser induzida após ativação via receptores Toll-like em repostas a produtos bacterianos, especialmente na presença de INF-g. No fagolisossomo o NO pode se combinar com o peróxido de hidrogênio ou com o ânion superóxido, gerando radicais altamente reativos, como o peroxinitrito, importantes para morte microbiana no fagossomo (Figura 4).


Figura 3 - Características gerais dos macrófagos na resposta inflamatória com ênfase para a fagocitose, ativação celular, com conseqüente produção dos mediadores inflamatórios, apresentação de antígenos e estimulação do reparo tecidual.

Entretanto, alguns microrganismos, como o Mycobacterium tuberculosis, são resistentes a esses métodos de digestão e permanecem vivos nos fagossomas de macrófagos por muito tempo. Numa tentativa de controlar o processo infeccioso, essas células se tornam grandes e multinucleadas (células gigantes). Juntamente com os linfócitos e fibroblastos que se acumulam ao seu redor, as células multinucleadas formam os granulomas, que nada mais são que uma alternativa do organismo para impedir a disseminação do microrganismo. Os danos teciduais causados por um processo inflamatório normalmente são mediados pelas ações do sistema imune contra um determinando imunógeno e os produtos antimicrobicidas liberados por macrófagos e neutrófilos. Entretanto, esses danos normalmente são limitados em extensão e duração e são reparados após eliminação do estímulo causal. Os macrófagos teciduais ativados, além da ação pró-inflamatória em determinado momento da reposta, também atuam tardiamente nos mecanismos de limpeza e reparo tecidual, produzindo citocinas e fatores de crescimento que levam à proliferação de fibroblastos, síntese de colágeno (mediada pela ação do TGF-b e do fator de crescimento derivado de plaquetas), formação de novos vasos e substituição do tecido lesado por tecido conjuntivo (fibrose).


Figura 4 - Papel dos macrófagos na inflamação: aumento da produção de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio pela interação com linfócitos Th1 e NKT, tanto mediada por citocinas quanto por moléculas de superfície (CD40 - CD40L).

Eosinófilos

Os granulócitos eosinófilos são células importantes no combate a infecções no geral, sendo sua ação antiparasitária (helmintos) uma das mais potentes e eficazes do organismo. São também importantes mediadores nas reações alérgicas e asma. Os eosinófilos se desenvolvem e maturam na medula óssea. Eles produzem e armazenam muitos grânulos protéicos secundários antes de sair da medula. Após a maturação, os eosinófilos circulam pela corrente sangüínea em pequenas quantidades, podendo ser encontrados em maiores números nas regiões de mucosas, como do trato gastrointestinal, respiratório e geniturinário. Durante a inflamação seu número pode aumentar na corrente sangüínea e eles podem então ter acesso aos sítios inflamatórios ou sítios de infecção por helmintos em reposta à ação de quimiocinas, como CCL11 (eotaxina-1), CCL24 (eotaxina-2), CCL5 (RANTES) e leucotrienos (LT). Nesses sítios infecciosos e/ou inflamatórios eles são ativados por citocinas Th2 (IL-5, GM-CSF e IL-3) que irão aumentar seu potencial efetor.

Uma vez ativados, os eosinófilos induzem ativamente inflamação e combatem a infecção por parasitas. A produção e liberação do conteúdo dos grânulos catiônicos eosinofílicos é um dos mecanismos importantes neste processo, denominado de degranulação. Esses grânulos são liberados após ligação cruzada do receptor para porção Fc da IgE (FceRI) com a IgE ligada ao antígeno alvo. Seu conteúdo possui grande potencial citotóxico sobre parasitas, mas pode também causar lesão e morte tecidual. A proteína básica principal (PBP), peroxidase eosinofílica (PE) e proteína catiônica eosinofílica (PCE) são os principais componentes dos grânulos liberados por estas células (Figura 5). A proteína catiônica eosinofílica é uma ribonuclease com propriedade antiviral. A PBP induz a degranulação de mastócitos e basófilos, e está envolvida também no remodelamento dos nervos periféricos. As proteínas catiônicas eosinofílicas criam poros na membrana da célula alvo, permitindo a entrada de outras moléculas citotóxicas dentro da célula, podendo apresentar ações diversas, tais como: a inibição da proliferação de células T, supressão da produção de anticorpos pelas células B, indução de degranulação de mastócitos e estímulo a fibroblastos para secreção de muco e glicosaminoglicanos. A peroxidase eosinofílica forma intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio que irão promover o estresse oxidativo no alvo, causando morte celular por apoptose e necrose. Além da ação dos grânulos eosinofílicos, outros mecanismos efetores merecem destaque, como a liberação de mediadores lipídicos pró-inflamatórios como os leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4) e as prostaglandinas (PGE2). Enzimas, como a elastase, e fatores de crescimento, como TGF-b, fator de crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de vasos endoteliais, contribuem como mecanismos de remodelação tecidual. Os eosinófilos também produzem uma variedade de citocinas que irão contribuir para o processo inflamatório, entre as quais se listam IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 e TNF-a.


Figura 5 - Mecanismo de citotoxicidade celular dependente de anticorpo realizado por eosinófilos. Os grânulos eosinofílicos liberados após ligação cruzada do receptor para porção Fc de IgE (FceRI) com a IgE ligada ao antígeno-alvo (helmintos) possuem grande potencial citotóxico sobre os parasitas, mas podem também causar lesão e morte tecidual.

Mastócitos

Os mastócitos são células mononucleares, teciduais, derivados de células progenitoras hematopoiéticas CD34 positivas, da medula óssea. Os progenitores migram pela corrente sangüínea para os tecidos periféricos e têm seu processo de diferenciação finalizado nos tecidos alvo, o que permite graus específicos de diferenciação de acordo com as características particulares dos microambientes (Kitamura et al., 1987 a, b). Os mastócitos estão estrategicamente localizados e são particularmente abundantes em áreas de contato com substâncias exógenas, como mucosas, serosas e pele, em associação a vasos sangüíneos e linfáticos, dentro e próximos a nervos periféricos, e em certas espécies, dentro das cavidades pleural e peritoneal. Portanto, os mastócitos podem interagir com células e elementos de vários tecidos, órgãos e cavidades do corpo, onde desempenham um papel primordial nas reações inflamatórias agudas (Soter et al., 1983).

Vários estímulos podem induzir os mastócitos a liberarem mediadores biologicamente ativos. Estes incluem: interação de antígenos específicos com receptores em sua superfície produtos sintetizados durante a ativação do complemento substâncias básicas, incluindo algumas derivadas de leucócitos e venenos de animais certos neuropeptídeos e diversos agentes físicos (trauma mecânico, calor e frio). Embora alguns desses agentes provoquem a liberação de mediadores pela destruição dos mastócitos, muitos causam a liberação dos mediadores por ativação celular e sem dano detectável. Os mastócitos ativados liberam mediadores potentes capazes de aumentar a permeabilidade vascular e induzir a expressão de moléculas de adesão, recrutando leucócitos circulantes, bem como macrófagos, e assim contribuindo para a fase precoce da inflamação. Os mediadores pré-formados incluem a histamina, serotonina, proteinases e proteoglicanos e os neoformados mediadores lipídicos, como o fator ativador de plaquetas (PAF) e derivados do ácido araquidônico, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Os mastócitos também sintetizam uma série de interleucinas e fatores de crescimento, como IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, fator de crescimento de fibroblastos, TNF-a (Tumor Necrosis Factor), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) e SCF (Stem Cell Factor).


Figura 6 - Ativação dos mastócitos a partir de interações com microrganismos. Os microrganismos, como bactérias e parasitos ou seus produtos, interagem com receptores específicos na superfície dos mastócitos, resultando em ativação, com conseqüente liberação de mediadores.

Um papel protetor importante desempenhado pelos mastócitos na resposta imune inata é o combate às infecções bacterianas. Camundongos deficientes em mastócitos são menos eficientes em eliminar as infecções e são mais susceptíveis à morte por infecção bacteriana aguda do peritônio do que animais sem deficiência. O papel protetor nesse ambiente depende do influxo de neutrófilos para o peritônio mediado pelo TNF-a liberado pelos mastócitos. Os mastócitos possuem múltiplos mecanismos para detectar invasões bacterianas, como receptores Toll-like (TLRs) 1, 2, 4 e 6 e receptores específicos, como o CD48 presentes na membrana celular, que ativam os mastócitos, levando à liberação de mediadores. O receptor CD48 se liga ao Fim H, expresso nas bactérias Escherichia coli, levando à morte da bactéria. Além disso, microrganismos podem ser opsonizados por produtos gerados pela ativação do sistema complemento como o C3a e C5a, tornando-se assim alvos preferenciais dos mastócitos. Como exemplo, temos a bactéria Salmonella typhimurium e o parasita Schistosoma mansoni, que são opsonizados pelo iC3b e são reconhecidos pelo receptor CR3 expresso na membrana dos mastócitos. Mediadores solúveis derivados de agentes infecciosos, como toxinas e constituintes da parede celular dos microrganismos, tais como os lipopolissacárides (LPS), também podem ativar os mastócitos, sendo que os efeitos desses produtos microbianos podem ser extremamente variáveis, resultando em ativação e liberação de mediadores responsáveis em promover a permeabilidade vascular, quimiotaxia (neutrófilos, basófilos), com conseqüente eliminação do microrganismo (Figura 6).

O exemplo clássico do envolvimento dos mastócitos está nas reações alérgicas em que, conjuntamente com o seu equivalente circulante, o basófilo, podem rapidamente, ao contato com o alérgeno, desencadear o mecanismo de hipersensibilidade do tipo I por apresentarem o receptor de alta afinidade para a IgE (FceRI). Após o estímulo, ocorre a degranulação e liberação de mediadores pré-formados, seguida posteriormente da liberação de mediadores neoformados. A liberação dos mediadores pelos mastócitos induz a migração de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), aumento da permeabilidade vascular, da secreção de muco, aumento da motilidade gastrointestinal e broncoconstrição, que constituem os sinais e sintomas de alergia e anafilaxia.

A grande variabilidade do número de mastócitos em diversos sítios anatômicos e as evidências de sua degranulação têm sido observadas em um amplo espectro da resposta imune inata e adaptativa (incluindo a produção de citocinas com função imuno-reguladora) bem como em grande número de patologias relacionadas às doenças. Além das reações de hipersensibilidade, os mastócitos têm participação também em processos neoplásicos, nas infecções parasitárias e bacterianas, enfermidades fibrosantes, doenças auto-imunes e na inflamação da sinóvia reumatóide.

A Figura 7 mostra, de maneira ilustrativa, a extraordinária complexidade dos mastócitos quando ativados, suas vias de transdução de sinal, seus mediadores bioquímicos e as conseqüências biológicas do recrutamento dos mastócitos.

Vários estudos histológicos têm relatado a presença de mastócitos na sinóvia normal humana. Hiperplasia de mastócitos tem sido descrita na membrana sinovial reumatóide, entretanto, a causa ainda não está bem estabelecida. Uma possibilidade é um aumento do recrutamento de mastócitos e seus progenitores de outros tecidos para o local da junta inflamada, mediado pelo SCF (stem cell factor) e o TGFb1 (transforming growth factor b1), que são substâncias quimiotáticas. A presença do SCF na sinóvia parece ter importante função, tanto na ativação como no crescimento, diferenciação e sobrevida de mastócitos sinoviais.

As funções efetoras dos mastócitos na sinóvia sugerem sua participação em diversas vias inflamatórias da artrite, incluindo o recrutamento de leucócitos, ativação e hiperplasia de fibroblastos, angiogênese e destruição da cartilagem e do osso (Nigrovic et al, 2005). Em sinovites crônicas, os mastócitos sintetizam mitógenos e citocinas que ativam os fibroblastos, atraem macrófagos e promovem a angiogênese, levando a hiperplasia e formação de tecido inflamatório altamente celular e invasivo (pannus). Os mastócitos também participam da destruição das juntas por indução dos fibroblastos e condrócitos a secretarem metaloproteinases de matriz e por promoção direta e indireta da diferenciação de osteoclastos. De fato, a participação de mastócitos com atividade quimiotática tem sido relatada em várias condições clínicas auto-imunes, incluindo a artrite reumatóide, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, doenças auto-imunes da tireóide, urticária crônica, pênfigos e aterosclerose.

Classificação da resposta inflamatória

A resposta inflamatória é em geral benéfica ao organismo, resultando na eliminação de microrganismos por fagocitose, lise pelo sistema do complemento, diluição ou neutralização de substâncias irritantes ou tóxicas pelo extravasamento local de fluidos ricos em proteínas, e pela limitação da lesão inicial pela deposição de fibrina. Em algumas situações, entretanto, esse processo pode ter conseqüências indesejáveis como, por exemplo, nas reações alérgicas e nas doenças auto-imunes. As reações inflamatórias mediadas pelo sistema imune, também denominadas reações de hipersensibilidade, são classificadas de acordo com o mecanismo desencadeador (Quadro 4).

As reações de hipersensibilidade imediata (tipo I) são caracterizadas pela presença de IgE e em geral desencadeadas por um antígeno externo (alérgeno). Podem se apresentar de forma sistêmica, envolvendo múltiplos órgãos, ou de modo mais restrito como na urticária e na rinite alérgica. A interação entre o alérgeno e a IgE pré-formada e pré-fixada a receptores de superfície de mastócitos e basófilos resulta na liberação de mediadores como histamina e na síntese de mediadores lipídicos como os derivados do ácido araquidônico. As rinites alérgicas, asma e reações anafiláticas são exemplos das reações tipo I.


Figura 7 - Visão geral dos eventos associados à ativação dos mastócitos. As conseqüências biológicas da ativação dos mastócitos variam conforme os subtipos dos mastócitos, estímulo ativador e tecidos adjacentes FGF: fator do crscimento de fibroblastos VEGF: fator de crescimento do endotélio vascular SCF: fator de célula-tronco TGF-b: fator do crescimento transformador-b TNF-a: fator de necrose tumoral a IL: interleucina LT: leucotrieno PAF: fator ativador de plaquetas PG: prostaglandina MHC: complexo de histocompatibilidade principal GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos.

As reações do tipo II dependem da produção de anticorpos das classes IgG e IgM contra um dado antígeno. O fato de a resposta humoral causar dano em vez de proteção depende da natureza do antígeno e do isotipo da imunglobulina formada. Os mecanismos de dano associados com as reações de tipo II incluem: 1) lise de células que apresentam o antígeno na sua superfície por ativação do sistema complemento 2) destruição por células NK que apresentam receptores Fc para IgG e realizam citotoxicidade mediada por anticorpo e 3) liberação de enzimas líticas e citocinas por neutrófilos e macrófagos ativados pela ligação de receptores Fc para IgG.

As reações tipo III são causadas pela formação de imunocomplexos (IC) antígeno-anticorpo, que se depositam nos tecidos e ativam o sistema complemento. Os anticorpos envolvidos precisam ser capazes de ativar complemento, o que inclui IgM, IgA e todas as subclasses de IgG exceto IgG4. Os IC circulantes podem se depositar em vasos, membrana basal de glomérulos e articulações, levando à ativação do complemento e resultando em inflamação tecidual, podendo ser traduzida por exantema, eritema nodoso, vasculite, nefrite, pneumonite e artrite. Esse tipo de reação de hipersensibilidade é encontrado em várias doenças auto-imunes como lúpus eritematoso sistêmico e formas graves de artrite reumatóide.

As reações do tipo IV, ou de hipersensibilidade tardia, são mediadas por linfócitos T, macrófagos e monócitos. Linfócitos T citotóxicos (CD8) causam dano tecidual direto enquanto linfócitos T auxiliadores (CD4) secretam citocinas que ativam e recrutam T citotóxicos, monócitos e macrófagos. Os macrófagos são os responsáveis pela magnitude da lesão tecidual e pela formação de granulomas característicos da persistência do agente infeccioso ou corpo estranho. Exemplos clássicos de reação do tipo IV são a tuberculose e a hanseníase em sua forma tuberculóide. Vasculite de células gigantes e arterite de Takayasu também parecem decorrer de mecanismos relacionados a hipersensibilidade do tipo IV.



Terapia biológica e inflamação

Agentes biológicos são compostos de origem biológica, como anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes, desenhadas e modificadas de forma a interagir com moléculas estratégicas na modulação da resposta inflamatória e imunológica. São freqüentemente empregados, com sucesso, para minimizar o processo inflamatório em diferentes doenças auto-imunes. Os principais alvos dos anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes são citocinas pró-inflamatórias, receptores de membrana e componentes do sistema complemento.

Agentes biológicos contra IL1
O anakinra é um análogo recombinante não glicosilado do antagonista do receptor da IL-1 (IL-1Ra) humano. O IL-1Ra é um antagonista competitivo do receptor da citocina pró-inflamatória IL-1. O IL-1Ra é fisiologicamente produzido em resposta à produção de IL-1 e compete com a IL-1b pela ligação com os receptores da IL-1 do tipo I, inibindo seus efeitos biológicos. O anakinra foi inicialmente estudado na artrite reumatóide, em diversos ensaios clínicos, e teve sua aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration), em 2001, para casos refratários a uma ou mais drogas modificadoras de doença na artrite reumatóide (DMARDs). Anakinra pode ser usado como monoterapia ou em associação com metotrexato. A meia-vida do anakinra é bastante curta (5,9 horas), o que pode proporcionar menor perfil de efeitos colaterais, porém com menor eficácia em alguns pacientes. O verdadeiro papel do anakinra na artrite reumatóide ainda está por ser estabelecido, principalmente após o advento de outros agentes biológicos. Todavia, novos estudos têm demonstrado bons resultados com seu uso em indivíduos com doença de Still do adulto, na forma sistêmica da artrite idiopática juvenil, em síndromes auto-inflamatórias (por exemplo, febre familiar do Mediterrâneo, tumor necrosis factor receptor associated periodic syndrome – TRAPS, síndrome de Muckle-Wells), na síndrome de Schnitzler, entre outras.

O moderado efeito terapêutico do anakinra surpreendeu os pesquisadores em vista do papel central da IL-1 na fisiopatologia da inflamação na artrite reumatóide. Por esse motivo, outros agentes antagonistas dos efeitos da IL-1 estão em desenvolvimento, entre os quais se destacam o receptor solúvel tipo I da IL-1 (sIL-1R1), IL-1Trap (proteína de fusão que se liga ao receptor tipo I da IL-1 e à proteína acessória do receptor da IL-1 inibindo-os) e o prainacasan, um inibidor sintético da enzima conversora de interleucina (ICE) ou caspase-1, a enzima que libera a forma ativa de IL-1 e IL18 a partir de seus precursores.

Agentes biológicos contra TNFa
Os agentes anti-TNFa são os principais medicamentos biológicos utilizados na reumatologia na atualidade. Seus representantes são o etanercepte, o infliximabe e o adalimumabe. O etanercepte é uma proteína de fusão obtida pela ligação do receptor p75 do TNF à fração Fc da IgG por técnicas de biologia molecular. O etanercepte liga-se a moléculas de TNFa circulantes, inibindo a ligação com seu receptor e evitando os efeitos biológicos do TNFa e do TNFb (linfotoxina). O etanercepte não causa citotoxidade de células que expressam o TNFa. O infliximabe é um anticorpo monoclonal anti-TNFa quimérico, ou seja, com uma porção de IgG1k humana e uma região murina Fv, oriunda de anticorpos murinos neutralizadores de alta afinidade anti-TNFa humano. O infliximabe se liga tanto ao TNFa livre quanto ao TNFa ligado à superfície celular, induzindo a lise dessas células por citotoxidade mediada por anticorpos. Diferente do etanercepte, o infliximabe não se liga ao TNF-b. O adalimumabe é um anticorpo monoclonal anti-TNFa IgG1 recombinante totalmente humano que tem meia vida prolongada e necessita de administração subcutânea menos freqüente. Em tese, tem ação semelhante à do infliximabe.

Etanercepte, infliximabe e adalimumabe são agentes bastante estudados e aprovados no tratamento da artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, espondilite anquilosante e da artrite psoriática. A associação desses agentes anti-TNFa ao metotrexato se mostrou mais eficaz que a monoterapia em pacientes com artrite reumatóide. No tratamento da doença de Crohn, o infliximabe e o adalimumabe também se mostraram eficazes em algumas situações específicas.

Uma segunda geração de agentes anti-TNFa está em avaliação em diferentes estudos. Esses agentes incluem certolizumabe pegol (CDP870), lenercepte, pegsunercepte e onercepte. O certolizumabe pegol (CDP870) é o fragmento da porção Fab de um anticorpo monoclonal anti-TNFa humanizado ligado ao polietilenoglicol, que vem sendo estudado em pacientes com artrite reumatóide e doença de Crohn. Devido a sua meia vida longa, o certolizumabe pegol pode ser administrado mensalmente por via subcutânea. O lenercepte é uma proteína recombinante de fusão que consiste de dois receptores p55 solúveis do TNFa (domínio extracelular) ligados à fração Fc da IgG1. Esse agente foi originalmente desenvolvido para o tratamento da artrite reumatóide e da sepse. Entretanto, o lenercepte não foi superior ao metotrexato no tratamento de pacientes com artrite reumatóide e não melhorou a evolução na sepse. Na esclerose múltipla, o lenercepte aumentou a freqüência de reativações. Esses resultados negativos desestimularam mais pesquisas para avaliar a eficácia desse agente anti-TNFa. O pegsunercepte é formado pelo receptor I solúvel p55 monomérico recombinante do TNFa (sTNFr1) ligado ao polietilenoglicol (PEGsTNFr1) para aumentar sua meia vida. Esse agente foi avaliado em pacientes com artrite reumatóide e se mostrou superior ao placebo em estudos fase II. O CDP571 é um anticorpo monoclonal humanizado anti-TNFa que foi avaliado em diversos ensaios clínicos em pacientes com doença de Crohn e apesar de bem tolerado, não se mostrou eficaz na indução de resposta ou na manutenção da remissão. Apesar de o CDP571 reduzir os níveis de PCR e de IL-6 em pacientes com artrite reumatóide, os benefícios clínicos desse agente ainda não foram bem descritos. O onercepte é o receptor solúvel p55 recombinante do TNFa que vem sendo estudado no tratamento da psoríase moderada a grave. Esse agente não se mostrou eficaz na terapia de indução da doença de Crohn.

Agentes biológicos contra IL6
A IL-6 é uma citocina que atua em diferentes células, sendo encontrada em altos níveis em diversas doenças inflamatórias. A IL-6 estimula hepatócitos a produzirem proteínas de fase aguda, como a proteína C reativa, o fibrinogênio, a proteína amilóide A, ao mesmo tempo em que diminui a produção de albumina. Recentemente, foi descrito que a IL-6 estimula a produção do peptídeo hepcedina que participa da patogenia de anemia associada a quadros inflamatórios. O tocilizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado contra o receptor solúvel da IL-6 que inibe os efeitos pró-inflamatórios dessa citocina. Ensaios clínicos têm demonstrado a eficácia desse agente biológico no tratamento da artrite reumatóide, da artrite idiopática juvenil e na doença de Castleman.

Agentes biológicos contra frações do complemento
O eculizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado anti-C5 que se liga à subunidade 2b da enzima C5 convertase e bloqueia a clivagem do C5, impedindo assim a geração do componente pró-inflamatório C5a e a formação do complexo de ataque de membrana C5b-C9. Esses efeitos resultam na inibição da resposta inflamatória exudativa e da lise celular. O eculizumabe é comprovadamente eficaz no tratamento da hemoglobinúria paroxística noturna. O eculizumabe foi estudado em modelo experimental de síndrome antifosfolípide e demonstrou diminuição da freqüência de reabsorção fetal em ratas prenhas em relação ao grupo controle, sugerindo participação importante do sistema complemento na patogenia da perda gestacional na síndrome antifosfolípide.

O pexelizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado de alta afinidade para o componente C5, inibindo também a clivagem deste pela C5 convertase. Esse agente biológico vem sendo estudado em pacientes com infarto agudo do miocárdio, mas não demonstrou efeito sobre a redução da área do infarto em pacientes submetidos à angioplastia primária e dados sobre seu efeito na redução da mortalidade no infarto agudo do miocárdio são controversos.




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