Home Busca Avançada Normas de Publicação Assinaturas Fale Conosco
Contact Us
 
 

 

CopyRight
Moreira Jr Editora
Proibida a reprodução sem autorização expressa


 
sêlo de qualidade
Like page on Facebook



Revisão
Linfócitos B: da imunobiologia aos imunobiológicos
Tânia Tieko Takao Catelan, Danilo Mesquita Jr.,
Reumatologistas
Júlio A. Pereira Araújo, Alexandre Wagner Silva de Souza, Luis Eduardo C. Andrade, Neusa Pereira da Silva
Reumatologistas
Wilson de Melo Cruvinel
Prof. Assistente de Imunologia dos cursos de Biomedicina e Medicina, Diretor do Departamento de Biomedicina da PUC-Goiás

Numeração de páginas na revista impressa: 35 à 57

Origem

Os linfócitos B se originam de células-tronco pluripotentes da medula óssea, que dão origem às células progenitoras mielóides e linfóides. Os progenitores linfóides, por sua vez, dão origem aos linfócitos B, T e células NK. Os linfócitos B são inicialmente produzidos no saco vitelino, posteriormente, durante a vida fetal, no fígado e finalmente na medula óssea. Na medula óssea a seqüência de rearranjos das imunoglobulinas e as alterações fenotípicas ocorrem durante a ontogenia das células B, de maneira análoga às células T do timo. As células que vão diferenciar-se em linfócitos B (LB) permanecem na medula óssea durante seu processo de maturação ao contrário dos LT que migram para o timo. Após a maturação as células B deixam a medula e caem na circulação, migrando para os órgãos linfóides secundários (Figura 1).

Os LB, diferentemente dos LT que dependem da apresentação de peptídeos pelo MHC, são capazes de reconhecer antígenos solúveis na sua forma nativa. As moléculas responsáveis pelo reconhecimento de antígenos nos LB são as imunoglobulinas de membrana IgM e IgD. O complexo do receptor de células B (BCR) inclui, além da imunoglobulina de membrana, duas cadeias peptídicas, denominadas Iga (CD79a) e Igb (CD79b), que se associam de modo não covalente, e têm função de dar início à sinalização intracelular após o encontro com o antígeno.

Características das imunoglobulinas

Cada molécula de imunoglobulina é constituída por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por pontes dissulfeto (Figura 2). Os genes das cadeias pesadas se situam no cromossomo 14 e os das cadeias leve k (kappa) e l (lambda) nos cromossomos 2 e 22, respectivamente. Existem cinco tipos diferentes de cadeias pesadas denominadas a, g, d, e e m, que definem as classes de imunoglobulina IgA, IgG, IgD, IgE e IgM, respectivamente. A especificidade de ligação ao antígeno é definida pela porção variável (Fab) da molécula, constituída pela união das regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve que constituem a imunoglobulina. As propriedades características da classe dependem da porção constante da cadeia pesada (Tabela 1).

Organização dos genes das imunoglobulinas

Cada cadeia de imunoglobulina, tanto leve quanto pesada, é formada a partir de segmentos gênicos que se rearranjam em uma seqüência específica para constituir a cadeia completa (Figura 3). A porção variável da cadeia pesada das imunoglobulinas é codificada pelos segmentos VH, DH e JH. Há mais de 50 genes VH, cerca de 25 DH e 6 JH dispostos seqüencialmente no cromossomo, seguidos das regiões constantes Cm, Cd, Cg3, Cg1, Ca1, Cg4, Cg2, Ce1 e Ca2. Nas cadeias leves os segmentos são: Vk (~35) e Jk (5) e um só segmento Ck no cromossomo 2 e Vl (~30) seguido de quatro conjuntos JlCl no cromossomo 22.

Maturação dos linfócitos B

A maturação dos linfócitos B tem início a partir das células pró-B que expressam na superfície as moléculas CD19 e CD10, que são restritas aos LB. Nesse estágio a célula inicia a expressão do gene desoxinucleotidiltransferase terminal, TdT, e dos genes ativadores da recombinação, RAG1 e RAG2 que comandam a recombinação gênica necessária para a produção de imunoglobulinas. A montagem da cadeia pesada se inicia com a combinação aleatória de um segmento D e um J que a seguir se unem a um segmento V, definindo a especificidade de reconhecimento do anticorpo que será formado, independentemente da porção constante que fará parte da cadeia completa (Figura 3). A cadeia pesada é a primeira a sofrer rearranjo e a célula, capaz de produzir uma cadeia pesada m no citoplasma, é denominada pré-B. A cadeia m se associa a uma cadeia invariável e é expressa na superfície como um pré-BCR, juntamente com as moléculas assessórias Iga e Igb. Em seguida ocorre o rearranjo da cadeia leve kappa e, na falha desta, da cadeia lambda. Cada LB apresenta, portanto, um único tipo de cadeia leve associado à cadeia pesada. O sucesso na expressão de uma IgM completa na superfície do LB leva à progressão da maturação com subseqüente produção de IgD de membrana por splicing alternativo a partir do pré-RNA mensageiro que contém as diferentes porções constantes.



Figura 1 - Estágios de maturação da célula B na medula óssea a partir da célula tronco pluripotente. Inicialmente os linfócitos B passam por ciclos de proliferação com concomitante expressão das cadeias do receptor da célula B (BCR). Células que falham na expressão do BCR são eliminadas e células que reconhecem proteínas próprias com elevada afinidade são estimuladas a sofrer morte apoptótica (seleção negativa). Na parte inferior da figura estão esquematizados os estágios seqüenciais no processo de maturação do LB, cada qual caracterizado pela expressão gênica de marcadores de superfície e imunoglobulinas.



É importante ressaltar que todo rearranjo gênico ocorre no início da maturação do LB, no estágio pré-B, ainda na medula óssea, e de modo totalmente independente de qualquer contato com antígeno.

O processo combinatório dos diferentes segmentos que compõem as porções variáveis das cadeias pesadas e leves e as diferentes possibilidades de associação entre elas resulta em cerca de 1011 de diferentes especificidades de reconhecimento pelas imunoglobulinas.

Mecanismos de seleção positiva e negativa atuam também durante a maturação dos LB. Na seleção positiva, ainda não totalmente esclarecida, aqueles LB imaturos expressando moléculas funcionais de Ig de membrana recebem sinais de sobrevivência para continuar o processo de maturação. No processo de seleção negativa, os LB imaturos, ainda na medula óssea, que reconhecem antígenos próprios com alta afinidade sofrem apoptose ou entram em um processo denominado edição de receptor, no qual os genes RAG são novamente ativados e outra combinação V-J de cadeia leve é gerada em substituição à anterior, auto-reativa.

Caracterização imunofenotípica

As células de linhagem B, durante sua maturação, passam por estágios caracterizados por um padrão específico de expressão de genes de imunoglobulinas e pela expressão de outras proteínas na membrana celular que servem como marcadores fenotípicos desses estágios de desenvolvimento (Figura 4).


Figura 3 - Recombinação e expressão dos genes das imunoglobulinas. Codificação da cadeia pesada a partir da recombinação dos exons D1 com o 6º exon do agrupamento J que em seguida recombinam com o exon V1. Os segmentos cromossômicos entre os exons escolhidos são deletados. Na seqüência o segmento V1D1J6 formado recombina-se com o segmento constante Cµ. Uma vez rearranjado, o DNA é transcrito em RNA mensageiro que é traduzido em uma cadeia polipeptídica que constitui a cadeia pesada da imunoglobulina. Na seqüência à direita está representado o processo de recombinação que resultará na formação da cadeia leve kappa a partir da recombinação dos exons V2 e J1.


Figura 4 - Marcadores imunofenotípicos do desenvolvimento normal da célula B em diferentes estágios de maturação.

O estágio inicial do desenvolvimento das células B é o estágio do progenitor da célula B (pró-B), que não produz imunoglobulinas (Ig), mas pode ser distinguida de outras células imaturas pela expressão de moléculas de superfície restritas à linhagem B, como o CD22 e CD19. Um dos marcadores mais precoces da linhagem B é o CD19 de membrana que continua a ser expresso em todas as fases da maturação de células B. As células pró-B podem ser divididas em três grupos com base na expressão de TdT, uma enzima intracelular expressa unicamente durante o rearranjo dos genes VH, e de um marcador denominado B220. Este é uma isoforma do antígeno comum de leucócitos (CD45R), que parece ser importante no controle da sinalização do receptor da célula B. As células pró-B iniciais expressam apenas TdT, as células pró-B intermediárias expressam TdT e B220 e as células pró-B tardias expressam B220 e são negativas para o TdT. O B220 continua sendo expresso na superfície durante todo o restante da ontogenia das células. Na medida em que a célula evolui no estágio pró-B, ocorre o rearranjo dos genes das cadeias pesadas das imunoglobulinas e as células começam a expressar CD43, RAG-1 e RAG-2.

O próximo estágio de desenvolvimento é representado pela célula pré-B, que é o tipo celular mais precoce que sintetiza um produto detectável do gene de Ig, a cadeia pesada m citoplasmática. As células pré-B são encontradas somente nos tecidos hematopoiéticos e não proliferam ou diferenciam em resposta a antígenos. No próximo estágio de maturação, cada célula B em desenvolvimento rearranja os genes e produz as cadeias leves k ou l, as quais se associam à cadeia pesada m previamente sintetizada para, então, expressar uma IgM completa na membrana. As células B que expressam apenas IgM de membrana são chamadas de células B imaturas. Seu encontro com antígenos, como os auto-antígenos da medula óssea, pode levar à morte celular ou a uma resposta não funcional, em vez de serem ativadas. Essas células B imaturas deixam a medula óssea e completam sua maturação nos órgãos linfóides secundários.

A célula B madura resulta do próximo estágio de desenvolvimento. Nesse estágio as células co-expressam as cadeia m e d em associação às cadeias leves k ou l e produzem ambas as moléculas IgM e a IgD. Ambas as classes de imunoglobulinas apresentam a mesma especificidade para o antígeno. A co-expressão de IgM e IgD é acompanhada da aquisição de competência funcional, por essa razão essas células são chamadas de células B maduras. As células B maduras podem ser encontradas no sangue e órgãos linfóides periféricos de indivíduos normais, sendo que a maioria são células IgM e IgD, reconhecem o antígeno com alta afinidade e sua ativação leva à resposta imune humoral.

O CD19 é expresso em um complexo com CD21 e CD81 um grupo de moléculas de superfície, também referido como complexo CD19, que exige, para a sua ativação, ligação do receptor das células B e uma molécula co-estimulatória importante, o CD40. A ligação deste complexo das células B e co-receptor pode reduzir o limiar de antígeno necessário para ativar as células B.

As células B ativadas proliferam e se diferenciam em células formadoras de anticorpos (plasmócitos). Os plasmócitos de indivíduos normais se caracterizam pela presença dos antígenos CD45+, CD19+, CD20+, CD38++, CD56-/fraco, CD138++, ausência de imunoglobulinas de membrana (mIg) e presença de imunoglobulina citoplasmática policlonais (cIg).

Van Zelm et al, 2006, relataram os primeiros casos de imunodeficiência humoral associado a deficiência de CD19 em humanos e mostraram que o CD19 não é essencial para o desenvolvimento das células B, mas é importante para a diferenciação de células B de memória e produção de anticorpos pelos plasmócitos. A presença de mutação homozigótica do gene CD19 em um paciente resultou em aumento de suscetibilidade às infecções, hipogamaglobulinemia e baixa resposta mediada por anticorpos. A expressão de CD19 de superfície era reduzida ou muito baixa, as células B maduras CD20+ circulantes estavam em números normais, CD81 e CD225 estavam normalmente expressos e os níveis de CD21 estavam diminuídos. Estes dados indicam que o CD19 é dispensável para o desenvolvimento das células B, mas é importante para a diferenciação de células de memória e plasmócitos, para produção de imunoglobulinas e, conseqüentemente, para a resposta mediada por anticorpos.

No mieloma múltiplo os plasmócitos expressam cIg monoclonal e não possuem mIg. A imunoglobulina mais comum é a IgG. Ocasionalmente há expressão de IgA e raramente IgG, IgE ou IgM. A molécula de imunoglobulina é completa em 85% dos casos, apresentando cadeias pesadas e leves, e em 15% dos casos apenas as cadeias leves kappa ou lambda estão presentes, o que corresponde à proteína de Bence-Jones. A maioria dos casos é CD45- ou CD45+fraco, não possui os marcadores pan-B CD19 e CD20, mas expressam CD38++, CD79a+, CD56 forte. A molécula de adesão CD138 (sindecan 1) é encontrada na maioria dos casos, sendo importante para a ancoragem dos plasmócitos na medula óssea. Apesar de aproximadamente 80% dos plasmócitos do mieloma múltiplo serem CD19- CD56+, cerca de 20% dos casos são CD19-CD56-. Os plasmócitos neoplásicos podem expressar antígenos das linhagens mielóide ou monocítica, como o CD13 (31% dos casos), CD15 (7%) e CD117 (43%).

Ativação dos linfócitos B

Os linfócitos B são responsáveis pela imunidade humoral que se caracteriza pela produção e liberação de anticorpos (Ac) capazes de neutralizar ou até mesmo destruir os antígenos (Ag) contra os quais foram gerados. Para a ativação dos LB, além do reconhecimento do antígeno, é necessário um segundo sinal de ativação.

Os linfócitos B virgens expressam duas classes de anticorpos ligados a membrana, IgM e IgD, que funcionam como receptores para antígenos associação com as proteínas Iga e Igb, formando o complexo receptor da células B (BCR). Os domínios citoplasmáticos de Iga e Igb contêm motivos de ativação de imunorreceptores baseados em tirosina (ITAMs) que, após ligação do antígeno ao complexo BCR, são fosforilados e recrutam diversas moléculas sinalizadoras. A sinalização induzida por receptores nas células B ativa fatores que promovem a transcrição de genes cujos produtos estão envolvidos na proliferação e diferenciação das células B (Figura 5).


Figura 5 - Complexo BCR e ativação da célula B. A partir da ligação cruzada das imunoglobulinas na superfície do LB são desencadeados eventos bioquímicos que iniciam com a fosforilação dos ITAMS (Motivos de ativação de imunorreceptores baseado em tirosina) com conseqüente ativação de enzimas e intermediários bioquímicos e ativação de fatores de transcrição.

Moléculas imunogênicas na forma nativa podem ser retidas por tempo longo pelas células dendríticas de origem mielóide, sendo, desse modo, transportadas até os órgãos linfóides secundários onde encontram os linfócitos B. O contato entre as duas células favorece o reconhecimento do antígeno pelo BCR, levando a célula dendrítica a liberar sinais de ativação para o linfócito B.

gOs linfócitos B funcionam também como células apresentadoras de antígeno e, assim, interiorizam o antígeno ligado à Ig de superfície (BCR), sendo o complexo processado por digestão intracelular. Após o processamento, os peptídeos gerados se ligam às moléculas de MHC classe II, formando complexos peptídeo/MHC classe II, que são então expressos na membrana dos linfócitos B para apresentação aos linfócitos Th CD4+. A interação do complexo peptídeo/MHC classe II com o TCR inicia a cadeia de eventos moleculares que levam os linfócitos Th à expansão clonal, com conseqüente produção de citocinas que estimulam a proliferação e diferenciação dos linfócitos B (Figura 6).

Proteínas do complemento também fornecem sinais secundários para a ativação das céulas B. Linfócitos B expressam na sua superfície um receptor para o fragmento C3d, denominado CR2 ou CD21. O CD21 forma um complexo com outras duas proteínas de membrana, CD19 e CD81. Por meio deste complexo, as células B específicas interagem com antígenos ligados ao fragmento C3d, simultaneamente ao reconhecimento do antígeno pela Ig de superfície. Esta ligação promove o início da cascata de sinalização de ambos os receptores, gerando uma resposta muito maior se comparada à resposta do antígeno não ligado à molécula C3d.

A possibilidade da ligação C3d/CR2 atuar como o segundo sinal para a ativação dos linfócitos B garante o desencadeamento da resposta ante a microrganismos e antígenos que ativam o complemento. Esse é também um mecanismo de amplificação da resposta imune humoral, uma vez que anticorpos capazes de ativar complemento vão resultar em maior estímulo dos LB (Figura 7).

Recentemente tem sido destacado o potencial das células B em desempenhar suas funções mediante ativação de outros receptores relacionados à resposta imune inata, tais como os Toll-Like Receptors (TLRs). Foi demonstrado que as células B expressam a maioria dos TLRs, tais como TLR-2, TLR-3, TLR-5 TLR-7 e TLR-9, respondendo a uma enorme variedade de ligantes que podem ser protéicos, polissacarídicos, lipídicos e outros.

A resposta dos LB a antígenos peptídicos requer a ajuda dos LTh e esses antígenos são por isso denominados "antígenos T dependentes". Muitos antígenos não protéicos, com epitopos repetitivos, não necessitam da cooperação dos LTh e são denominados "antígenos T independentes".


Figura 6 - Diferentes processos de ativação do linfócito B.

Características da resposta T dependente

A resposta do anticorpo para os antígenos protéicos requer o reconhecimento do antígeno pelas células T auxiliares e a cooperação entre as células B antígeno-específicas e os linfócitos T. Estes, por sua vez, estimulam a expansão clonal das células B, a mudança de classe, a maturação da afinidade e a diferenciação em células B de memória (Figura 8).

A apresentação de antígenos processados pelos LB ativados ao TCR permite a aproximação e contato dos linfócitos, importante para garantir a transmissão de sinais de ativação. Os linfócitos T expressam na sua superfície moléculas CD40, que interagem com seu ligante, CD40L, expresso na superfície de linfócitos B, além disso, linfócitos T expressam CD28 que se liga às moléculas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), cuja expressão na membrana das células B ativadas é significantemente aumentada. Esses dois pares de moléculas, CD40/CD40-L e CD28/B7, permitem a aderência entre as células pelo período necessário para que se complete a transmissão dos sinais de estímulo, além de direcionarem a produção de enorme variedade de citocinas. Estudos experimentais comprovaram a importância da interação CD40-CD40L no direcionamento da resposta imune humoral. Camundongos knockout para tais moléculas apresentam defeitos profundos na produção de anticorpos, mudança de classe, maturação de afinidade e geração de células B de memória em resposta a antígenos protéicos.

Nos últimos anos, estudos em modelos murinos demonstraram que a resposta T dependente requer a ativação dos TLRs das células B. Segundo os autores, essa ativação é importante para direcionar a mudança de classe de imunoglobulinas, principalmente mediada pelo TLRA-9, além de estimular células B de memória a se diferenciarem em plasmócitos de longa duração, mantendo altas concentrações de anticorpos no soro, por um longo período. Foi demonstrado ainda que os ligantes de TLRs são os estímulos mais potentes para produção de citocinas pelas células B e que essa produção pode ser aumentada pelo co-estímulo derivado de células T tal como a interação CD40/CD40L.


Figura 7 - Interação do linfócito B com linfócito T auxiliar com conseqüente produção de citocinas ativadoras da resposta imune humoral. Destaque para as moléculas de superfície envolvidas no processo de ativação.

O reconhecimento de antígenos pelas células B aumenta a expressão de receptores para citocinas. As diferentes citocinas podem atuar de forma sinérgica ou antagônica na síntese de anticorpos e possuem diferentes efeitos. As citocinas produzidas pelas células T, tais como IL-2, IL-4 e IL-5, aumentam a proliferação de linfócitos B. A IL-6 produzida por macrófagos, células T e várias outras células em resposta à ativação de TLRs, é um fator de crescimento para as células B já diferenciadas e secretoras de anticorpos, principalmente IgM.


Figura 8 - Etapas das respostas imunes específicas humorais. Linfócitos B virgens expressando IgM e IgD de superfície. Interação e processamento antigênico com conseqüente apresentação dos peptídeos para linfócitos Th2 que ativam as células B. Diferenciação em plasmócitos secretores de anticorpos. Algumas células podem começar a produzir anticorpos de diferentes classes de cadeias pesadas (troca de classe de cadeia pesada). A exposição repetida a antígenos protéicos resulta na produção de anticorpos, com maior capacidade de ligação ao antígeno (maturação da afinidade).


Figura 9 - Mudança de isótipo de cadeia pesada das imunoglobulinas. A partir da ativação das células B mediada pela interação CD40-CD40L e ação das citocinas ocorre mudança de classe nos diferentes isótipos responsáveis pelas diferentes respostas efetoras. IgG, fagocitose dependente de anticorpo, ativação do sistema complemento e imunidade neonatal IgE, imunidade contra helmintos e desgranulação dos mastócitos IgA, proteção de mucosas IgM, ativação do sistema complemento.

Mudança de classe de imunoglobulinas

A etapa de diferenciação se caracteriza por alterações significativas na morfologia dos linfócitos e também por um novo rearranjo gênico, cuja conseqüência é a troca da porção constante da cadeia pesada da imunoglobulina IgM ou IgD para IgG, IgA ou IgE, processo conhecido com mudança de classe. Apesar dessa troca, a cadeia leve permanece a mesma, conseqüentemente a especificidade antigênica do anticorpo não é alterada, mas a resposta imune se torna mais diversificada, uma vez que as classes de Ig apresentam diferentes características funcionais.

O evento de mudança de classe é regulado por diversos fatores, como ligação com o receptor CD40 em células T e fatores solúveis como interleucina-4 (IL-4), IL-5, interferon-g (INF-g) e fator de necrose tumoral b (TNF- b) (Figura 9).

O sinal gerado pela interação CD40/CD40L parece atuar de forma global no início do processo de mudança de classe. Pacientes com um tipo de deficiência de imunoglobulinas ligada ao X apresentam baixa expressão de CD40 em células T ativadas, conseqüentemente as células B apresentam um defeito no processo de mudança de classe de imunoglobulinas o que causa um aumento nos níveis séricos de IgM, mas não no de IgG, IgA ou IgE, tornando o paciente suscetível a infecções piogênicas, bem como ao desenvolvimento de doenças auto-imunes e linfoma.

Maturação da afinidade

No início da resposta, quando há antígeno suficiente para interagir com células tanto de alta quanto de baixa afinidade, os anticorpos produzidos são heterogêneos. Com o curso da resposta, quantidades maiores de anticorpos são produzidas e se ligam ao antígeno, levando à diminuição da sua disponibilidade. Nessa fase, os linfócitos B com Ig de maior afinidade e, portanto, que interagem melhor com o determinante antigênico serão preferencialmente estimulados. Esse processo é denominado maturação da afinidade. O aumento da afinidade de anticorpos para um antígeno em particular, durante a progressão da resposta humoral T dependente, é resultado de mutação somática nos genes de Ig durante a expansão clonal, seguido pela sobrevivência seletiva de células B produtoras de anticorpos de altíssima afinidade. Para que isso ocorra é fundamental a interação CD40/CD40L, bem como a presença de fatores solúveis e, por isso, a maturação de afinidade ocorre somente na resposta aos antígenos T dependentes.

Os mecanismos de mutação somática nos genes das Ig são pouco conhecidos. É sabido que o rearranjo VDJ é altamente suscetível a mutações, sugerindo aumento da sensibilidade dessa região aos fatores que ligam ao DNA promovendo as tais mutações.

Acredita-se que a repetida estimulação com antígenos protéicos T dependentes leva ao aumento do número de mutações nos genes das células B antígeno-específicas presentes nos centros germinativos. Dessa forma, os anticorpos produzidos numa resposta secundária apresentam afinidade média mais alta que os produzidos na primária. Algumas destas mutações vão gerar anticorpos de alta afinidade, contudo, outras podem resultar na diminuição ou mesmo na perda da capacidade de ligação com o antígeno. A seleção positiva de LB produtores de anticorpos de alta afinidade garante a sobrevivência dessas células. Esse processo é importante na eliminação de antígenos persistentes ou recorrentes (Figura 10).

Alguns autores têm questionado a necessidade absoluta de células T na iniciação da produção de auto-anticorpos contra alguns auto-antígenos, após ter-se verificado que a ligação simultânea de um auto-antígeno (DNA, RNA) ao BCR e ao TLR pode fazer com que auto-anticorpos sejam produzidos. Estes, por sua vez, estimulariam a apresentação dos complexos Ac-auto-Ag aos TLR de células dentríticas plasmocitóides, iniciando a ativação de células T auto-reativas e amplificando, assim, a resposta auto-imune. Em camundongos transgênicos, foi observado que o desenvolvimento de auto-immunidade (lúpus) prossegue mesmo na ausência de células T.


Figura 10 - Ativação da célula B por antígenos protéicos e células T auxiliares (LTH2) com conseqüente migração dentro do centro germinativo. Os LB ativados gerados no centro germinativo sofrem mutações somáticas para os genes da região variável das imunoglobulinas. São gerados receptores com diferentes afinidades para os antígenos.

Mediante contato com o antígeno na superfície de células dendríticas são selecionados os linfócitos B, cujos receptores reconhecem com alta afinidade o antígeno. Estas células terão vantagem seletiva para sobreviver, enquanto a quantidade de antígeno decresce durante a resposta imune. Isso leva ao aumento da afinidade dos anticorpos pelo antígeno enquanto a resposta imune humoral evolui.

Somente células B com receptores com alta afinidade para o antígeno recebem estímulo para sobreviver. Os linfócitos B que não apresentam alta afinidade morrem.


Características das respostas primárias e secundárias de anticorpos

As respostas primárias e secundárias dos anticorpos para os antígenos protéicos diferem qualitativa e quantitativamente.

Resposta primária

O primeiro contato com um antígeno, por exposição natural ou vacinação, leva à ativação de linfócitos B virgens que se diferenciam em plasmócitos produtores de anticorpos e em células de memória, resultando na produção de anticorpos específicos contra o antígeno indutor. Na resposta primária, após contato com o antígeno, ocorre um período de latência, que compreende ao intervalo entre o contato e o aparecimento de níveis detectáveis de anticorpos. Esse período varia de cinco dias a várias semanas, dependendo do tipo e da dose do antígeno, da via de introdução, de características do indivíduo e do método usado para detectar os anticorpos. Após o início da resposta se observa uma fase de aumento exponencial dos níveis de anticorpos, seguida por uma fase denominada platô, na qual os níveis não se alteram. Segue-se a última fase da resposta primária, a fase de declínio, na qual ocorre uma diminuição progressiva dos anticorpos específicos circulantes.


Figura 11 - Visão geral das respostas humorais primária e secundária. As células B virgens nos tecidos linfóides periféricos são ativadas a partir do contato com o antígeno, proliferam e se diferenciam em células secretoras de anticorpos e células B de memória. A resposta secundária é mais rápida e ocorre a partir da ativação das células B de memória, promovendo a produção de maiores quantidades de anticorpos da classe IgG, troca de classe de cadeia pesada e maturação da afinidade.

Resposta secundária

Ao entrar em contato com o antígeno pela segunda vez, já existe uma população de linfócitos B capazes de reconhecer esse antígeno pela expansão clonal e formação de células de memória que ocorreram durante a resposta primária. A resposta secundária difere da primária nos seguintes aspectos: a dose de antígeno necessária para induz a resposta é menor a fase de latência é mais curta e a fase exponencial é mais acentuada a produção de anticorpos é mais rápida e são atingidos níveis mais elevados a fase de platô é alcançada mais rapidamente e é mais duradoura e a fase de declínio é mais lenta e persistente (Figura 11).

A magnitude da resposta secundária depende também do intervalo de tempo entre o contato com o antígeno. A resposta será menor se o intervalo for muito curto ou muito longo. Se for muito curto, os anticorpos ainda presentes se ligam ao antígeno e os complexos Ag/Ac formados serão rapidamente eliminados se for muito longo, é possível que as células de memória se tenham esgotado gradualmente com o tempo, embora a capacidade para deflagrar uma resposta secundária possa persistir por meses ou anos. O período ótimo para a indução de resposta secundária é logo após a queda do nível de anticorpos da resposta primária abaixo dos limites de detecção.

Nos dois tipos de respostas, primária e secundária, há a produção dos isótipos IgM e IgG, porém, na resposta primária IgM é a principal Ig e a produção de IgG é menor e mais tardia. Na resposta secundária a IgG é a imunoglobulina predominante. Nas duas respostas a concentração de IgM sérica diminui rapidamente de maneira que, após uma ou duas semanas, não é mais detectada, enquanto que a produção de IgG é persistente.

Características da resposta T independente

Antígenos T independentes podem estimular a produção de anticorpos na ausência total ou relativa de linfócitos T. Esses antígenos, usualmente, são moléculas não protéicas, poliméricas, que estimulam a produção de Ig de baixa afinidade, pertencentes, na sua maioria, à classe IgM. Como, geralmente, não há ativação de linfócitos T, não ocorre mudança de classe, nem maturação de afinidade ou formação de linfócitos B de memória. Raramente antígenos T independentes podem estimular a produção de citocinas com conseqüente mudança para outros isótipos.

A importância dos antígenos T independentes reside no fato de que a parede celular de muitas bactérias é composta por polissacarídeos que pertencem a esta categoria de antígenos e a imunidade humoral é o mecanismo mais importante de defesa do hospedeiro contra infecções por bactérias encapsuladas. Por essa razão, indivíduos com deficiências congênitas ou adquiridas que prejudiquem a resposta humoral são especialmente suscetíveis a infecções, muitas vezes fatais, por bactérias encapsuladas. Outro exemplo de resposta aos antígenos T independentes são os anticorpos naturais, presentes na circulação de indivíduos normais e produzidos aparentemente sem exposição antigênica. Muitos destes anticorpos naturais são anticarboidratos e de baixa afinidade postula-se que sejam produzidos por células B peritoneais, isto é, células B1, estimuladas por bactérias que colonizam o trato gastrointestinal e por células B da zona marginal dos órgãos linfóides. Anticorpos contra antígenos glicolipídicos A e B do grupo sangüíneo são outro exemplo de anticorpos naturais.

Células B regulatórias (BREGS)

Mais do que capacidade de processamento antigênico com concomitante ativação de respostas imunes humorais TH2 mediadas, há evidências de que as células B possuem capacidade imunorregulatória, essencial na manutenção da tolerância periférica.

Bhan e Mizoguchi foram os primeiros a introduzir o conceito de células B regulatórias (BREGS) a partir de estudo com camundongos deficientes de células B (B-) cruzados com camundongos que não expressavam TCRa (TCRa-/-) e desenvolviam espontaneamente colite crônica. Os autores observaram que os camundongos duplamente afetados (B-/TCRa-/-) apresentaram desenvolvimento mais precoce da doença e inflamação mais exacerbada quando comparadoscom os animais TCRa-/-, mas que tinham células B. De modo surpreendente os pesquisadores comprovaram que, naquele modelo experimental, era possível minimizar o efeito da colite no grupo B-/TCRa-/- pela administração de imunoglobulinas purificadas e de auto-anticorpos anticélulas epiteliais colônicas. A melhora observada nesse grupo foi acompanhada de aumento no clearance de células apoptóticas favorecido pelos auto-anticorpos produzidos pelas BREGS.

A partir de então outros estudos em modelos experimentais comprovaram a existência de células com capacidade imunomoduladora no pool de células B que, em um ambiente cronicamente inflamado, diferenciam-se em um fenótipo com alta expressão de CD1d, com capacidade de produção de IL-10 e habilidade para suprimir a resposta inflamatória mediante regulação das cascatas de ativação de IL-1b e STAT3. As BREGS dependem ainda de interação antigênica e estimulação via molécula CD40 e B7, mas, uma vez ativadas, produzem IL-10 e TGF-b que suprimem a ativação e diferenciação de linfócitos CD3+CD4+, CD3+CD8+ e células NK/T, inibem a ativação de células dendríticas e estimulam a diferenciação de células T regulatórias. Mediante contato das BREGS com células T naive há inibição na ativação da célula T e na diferenciação TH1 (Figura 12).

O estudo das BREGS em modelos animais deixa claro o papel regulatório dessas células nas diferentes enfermidades. A comprovação da existência dessas células em humanos será de grande relevância para a compreensão das doenças auto-imunes. Mais do que entender a diversidade de efeitos das citocinas antiinflamatórias que asseguram as funções das BREGS o seu estudo reforça as evidências da produção de auto-anticorpos de modo fisiológico com finalidade protetora.

Subtipos especiais de células B efetoras

As células B atuam como células efetoras de resposta rápida e efetiva após uma experiência antigênica anterior, sofrendo expansão clonal e diferenciação em células plasmáticas de vida longa e células B de memória. Muitas vezes essas respostas são dependentes do auxílio de linfócitos T, gerando as chamadas respostas humorais T dependentes. No entanto, além da célula B convencional (B-2), existem outros subtipos de células B, como as células B-1 e as células B da zona marginal (MZ-B) do baço, que atuam como verdadeiras sentinelas de sítios anatômicos específicos, como: cavidade peritoneal, pleural e zona periférica do baço, respectivamente. Esta compartimentalização provavelmente está relacionada à importante função exercida por estas células nos nichos que ocupam no sistema imune. Estas subpopulações se assemelham muito às células Tgd e aos linfócitos NKT no que se refere à localização em regiões específicas e função efetora com a utilização de receptores conservados, capazes de reconhecer uma variedade limitada de patógenos. Ambas as classes exercem tanto as funções de células da imunidade inata como da resposta adaptativa. Provavelmente por pertenceram aos dois tipos de resposta, estas células representam uma forma primitiva e conservada de imunidade.

Células B-1

As células B-1 constituem uma subpopulação distinta de células B, que difere em vários aspectos das células B-2 convencionais. Elas possuem uma forte capacidade auto-renovadora e são encontradas principalmente na cavidade pleural, peritoneal e em menor quantidade no baço. São responsáveis pela produção da maior parte das IgM naturais e também da maioria dos anticorpos de classe IgM, incluindo anticorpos contra células T, dsDNA, eritrócitos e anticorpos que fazem reação cruzada contra constituintes bacterianos comuns. Tem sido sugerido que elas representam uma relíquia evolutiva do sistema inato, que se originou de uma linhagem primitiva da imunidade inata, tornando-se uma célula linfóide do sistema adaptativo, mas que ainda mantém muitas características de uma célula do sistema inato. Elas parecem representar a primeira linha de defesa contra infecções sistêmicas direcionadas a vírus e bactérias e são de fundamental importância para o equilíbrio homeostático do organismo, produzindo anticorpos polirreativos e de baixa afinidade, importantes para remoção de células envelhecidas e/ou que sofreram estresse celular.

As células B-1 expressam baixos níveis dos marcadores B220/CD45R, CD19, Mac-1 e IgD de superfície e alta expressão de IgM de superfície e são subdivididas em dois grupos principais: B-1a e B-1b. As células B-1a expressam a molécula CD5 de superfície em níveis intermediários, já as B-1b são CD5- e capazes de diferenciação em células com características mielomonocíticas com função e morfologia semelhante ao macrófago. Foi mostrado recentemente que as células B-1b que residem na cavidade pleural e peritoneal são capazes de migrar para a periferia, perdendo a expressão de marcadores de linhagem linfocítica como a IgM e o CD19 de superfície. No local da infecção, essas células são capazes de produzir grande quantidade de IL-10 no decorrer do processo inflamatório e possuem também capacidade de apresentar antígenos às células T. Foi verificado que a secreção de IL-10 pelas células B-1 modula a atividade fagocítica do macrófago in vitro e a apresentação de antígenos na presença de IL-10 induz à tolerância ou diferenciação de células T em células supressoras, indicando um possível papel imunomodulador desta população celular. Foi demonstrado também que as células B-1 por meio da produção de anticorpos naturais atuam como células protetoras contra o desenvolvimento de doenças auto-imunes e aterosclerose.

Células B da zona marginal

As principais populações de células B efetoras do baço são as células da zona marginal (MZ-B) e as células B foliculares (FC-B). As células MZ-B são populações especializadas localizadas na região periférica ou marginal do baço, região denominada de sinusóide esplênico. Neste sítio estão localizados também os macrófagos da zona marginal que junto com as células MZ-B representam a primeira linha de defesa rápida, contra antígenos particulados da corrente sangüínea. No entanto, fenotipicamente, estas células são muito semelhantes às células B convencionais, sendo classificadas também no grupo de linfócitos B-2.

As células FC-B, localizadas nos folículos linfóides, atuam em um estágio mais avançado da resposta, gerando as células B de memória e plasmócitos por meio da resposta humoral T dependente comentada anteriormente nesta revisão.

As células MZ-B, assim como as células B-1, possuem um repertório de reconhecimento antigênico limitado, normalmente auto-reativo. Mas, ainda que auto-reativos, eles são também polirreativos, com especificidade importante tanto para remoção de restos celulares como para o reconhecimento de antígenos bacterianos e virais. Outra característica importante destas células é a propriedade que elas têm de gerar as chamadas respostas humorais T independentes, ou seja, podem responder avidamente a estímulos antigênicos e se diferenciarem em células secretoras de anticorpos sem a necessidade de auxílio de linfócitos T. Juntas, estas duas populações fazem parte das chamadas respostas de memória natural, pois geram rapidamente células efetoras nos estágios iniciais da resposta imune.

Considerações finais

Existem diferentes populações de células B maduras que podem ser encontradas em diferentes sítios anatômicos, com funções muitas vezes diversificadas. As células B-1 e MZ-B parecem ser pré-selecionadas para reagirem a antígenos capazes de gerar respostas T independentes, atuando como células B de memória inata. As células B foliculares atuam como percussoras das repostas imunes T dependentes e podem sofrer adaptações celulares e moleculares em resposta ao estímulo antigênico. Como resultado, temos as respostas mediadas por células plasmáticas maduras de vida longa capazes de sintetizar uma quantidade substancial de anticorpos de alta avidez por toda vida. Estas respostas T dependentes também elaboram um compartimento de células B de memória não secretoras de anticorpos, que responde vigorosamente à reexposição antigênica. Muitas vezes durante uma resposta efetora as células B podem comportar-se tanto como células efetoras ativas quanto como células imunomoduladoras, denominadas BREGS. Estas últimas são capazes de controlar a magnitude da resposta humoral e celular, trazendo de volta a homeostase imune e auxiliando na manutenção da tolerância periférica.

Assim, compartimentos distintos de células B antígeno-específicas podem ser recrutados na resposta efetora após um estímulo local ou sistêmico. Os eventos moleculares necessários para seu desenvolvimento, seleção, migração e ativação ainda estão sendo investigados e a compreensão destas vias irá permitir no futuro a manipulação específica de vias efetoras celulares e humorais de maneira a facilitar a imunidade a microrganismos ou prevenir doenças.


Figura 12 - Mecanismos efetores supressivos das células B regulatórias (BREGS) na resposta Imune. Os mecanismos de supressão sobre diferentes alvos celulares são dependentes da secreção de IL-10 e TGF-b.


Figura 13 - Esquema da resposta do hospedeiro aos desafios antigênicos. Níveis relativos de antígenos e a contribuição das células da resposta imune no decorrer do tempo. Quantitativamente, a maioria dos antígenos é removida precocemente pelos mecanismos efetores da resposta inata. A resposta adaptativa pode levar de dias a semanas para tornar-se completamente efetiva. Entre estes dois estágios da resposta imune estão as células de memória natural, que garantem uma ótima transição de um estágio ao outro, impedindo a disseminação do patógeno e facilitando sua remoção. Modificado de Martin & Kearney (Current Opinion in Immunology 2001, 13:195-201).

Terapia biológica antilinfócito B

Os linfócitos B têm importante papel na patogenia de diversas doenças auto-imunes, o que tem estimulado a investigação de agentes biológicos que atuem em alvos terapêuticos nessas células, levando à depleção ou ao bloqueio de sua ação.

Atualmente, os principais alvos terapêuticos em linfócitos B são suas moléculas de superfície (p.ex. CD20 e CD22), a citocina BLyS (B lymphocyte stimulator) e APRIL (a proliferating inducing ligand), além de seu receptor solúvel (TACI - transmembrane activator and CAML interactor) (Figura 13).

Rituximabe

O rituximabe é o principal medicamento desenvolvido e estudado como terapia antilinfócito B. Ele é um anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 composto por uma porção IgG1 Fck humana e por uma porção murina com a cadeia variável leve e pesada (IDEC-2B8) que tem especificidade para a molécula CD20 humana. O CD20 é uma fosfoproteína encontrada na superfície apenas de linfócitos B maduros e de células pré-B, não sendo encontrada em células tronco nem em plasmócitos.

O uso do rituximabe leva à depleção seletiva de linfócitos B (CD20+) por até 6 meses, havendo recuperação para níveis normais em 9-12 meses. Três mecanismos principais são responsáveis pela depleção de linfócitos B induzida pelo rituximabe (Figura 14):

· Citotoxicidade celular mediada por anticorpo: células NK, macrófagos e monócitos se ligam ao complexo formado pelo rituximabe e pelo CD20 na superfície celular através de seus receptores Fcg, produzindo a citólise do linfócito B

· Citotoxicidade dependente do complemento: o complexo rituximabe-CD20 se liga ao C1q e ativa a cascata do complemento pela via clássica, o que leva à lise do linfócito B pelo complexo de ataque de membrana

· Indução da apoptose de linfócitos B CD20+.

Em 1997, o rituximabe foi o primeiro anticorpo monoclonal aprovado para o tratamento do linfoma não Hodgkin de células B, folicular e de baixo grau, que se apresentava refratário e com recidivas. No linfoma folicular, o rituximabe pode ser utilizado como agente isolado ou em associação a quimioterapia e imunoadjuvantes (interferon-a2a, interleucina-2 e fator estimulante de colônias granulocítico e macrofágico, GM-CSF). Após a aprovação para uso no linfoma, o rituximabe foi utilizado em outros tipos de linfoma, em doenças de linfócitos B (macroglobulinemia de Wäldenstrom e mieloma múltiplo) e na doença de Castleman.

Na artrite reumatóide (AR) o rituximabe foi avaliado em grandes ensaios clínicos e demonstrou ser seguro e eficaz. Em primeiro estudo, pacientes refratários ao tratamento com drogas de base, que utilizaram a associação de rituximabe à ciclofosfamida e a associação de rituximabe com metotrexate, obtiveram melhor resposta ao tratamento em comparação com aqueles que utilizaram apenas metotrexate ou rituximabe isoladamente. No estudo DANCER, pacientes com AR refratária a 1-5 drogas de base apresentaram melhor resposta à associação de rituximabe e metotrexate. Em estudo subseqüente (estudo REFLEX), pacientes com AR que não haviam respondido ou apresentaram intolerância ao uso de agentes anti-TNF-a apresentaram boa resposta à associação rituximabe e metotrexate quando comparados ao uso isolado de metotrexate.


Figura 14 - Visão esquemática dos principais alvos imunobiológicos relacionados à célula B. Os principais alvos terapêuticos incluem moléculas de superfície (CD20 e CD22), as citocinas BLyS (B lymphocyte stimulator) e APRIL (a proliferating inducing ligand) e o receptor solúvel (TACI - transmembrane activador and CAML interactor).

O rituximabe foi eficaz no tratamento da AR independente da presença de fator reumatóide. Em todos os estudos, a depleção de linfócitos B foi medida pelo CD19 e ocorreu rapidamente, durando geralmente mais de seis meses. A AR reativava com a repopulação de linfócitos B e novos ciclos de tratamento foram necessários para manter a doença sob controle. Atualmente, ele também tem seu uso aprovado para o tratamento da artrite reumatóide em pacientes que falharam ao uso de anti-TNF-a.

No lúpus eritematoso sistêmico (LES), o rituximabe foi estudado em diversas séries de casos e tem apresentado resultados variados no controle de diversas manifestações da doença, principalmente na nefrite e no envolvimento neurológico refratários. Ensaios clínicos fase II/III em andamento responderão a estas questões. Apesar do relato de dois casos fatais de leucoencefalopatia multifocal progressiva por reativação de infecção pelo poliomavírus em dois pacientes com LES que haviam recebido rituximabe, esse medicamento parece ser muito bem tolerado em pacientes com LES. Não está certa qual a real participação do rituximabe nesses casos, pois a leucoencefalopatia multifocal progressiva já fora relatada em mais de 20 pacientes com LES e que não utilizavam rituximabe.

Na síndrome de Sjögren o rituximabe foi avaliado em séries de casos e pequenos estudos controlados e foi obtida uma boa resposta na maioria dos casos. Em vasculites sistêmicas o rituximabe foi avaliado principalmente em séries de casos de pacientes com granulomatose de Wegener refratária ao tratamento de indução. Os pacientes com doença generalizada, ANCA positivo e com vasculite sistêmica apresentaram melhor resposta do que aqueles que apresentavam doença granulomatosa. Dois ensaios clínicos que avaliam o rituximabe no tratamento de indução de pacientes com granulomatose de Wegener estão em andamento.

Outras doenças auto-imunes como a púrpura trombocitopênica imunológica, crioglobulinemia mista do tipo II e miopatias inflamatórias apresentam resultados promissores em séries de casos e são perspectivas futuras de benefício com o uso do rituximabe.


Figura 15 - Esquema ilustrando os três principais mecanismos responsáveis pela depleção de linfócitos B induzida pelo rituximabe. Lise mediada pela ativação do sistema complemento, no qual o complexo rituximabe-CD20 é ligado pelo componente C1q, ativando a via clássica. Citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC), realizado por células NK, macrófagos e monócitos que se ligam ao complexo formado pelo rituximabe e pelo CD20 na superfície celular, promovendo a citólise do linfócito B e indução da apoptose da célula B a partir da ativação de vias apoptóticas.


Figura 16 - Visão esquemática dos principais imunobiológicos relacionados à célula B. Estão indicados o alvo, bem como o efeito sobre os linfócitos B.

Outros imunobiológicos que atuam sobre células B (Figura 15)

Ocrelizumabe
O ocrelizumabe é o anticorpo monoclonal anti-CD20 de segunda geração, humanizado e que tem a mesma especificidade do rituximabe. Ensaios clínicos fase III estão em andamento para avaliar sua eficácia em pacientes com linfoma não Hodgkin, AR, LES, e com nefrite lúpica. Na esclerose múltipla se planeja realizar estudo fase II para casos que apresentem reativação e remissão.

Ofatumumabe
O ofatumumabe é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado que atua inibindo a ativação de linfócitos B. Encontra-se em estudos fase III para leucemia linfocítica crônica e linfoma não Hodgkin. Na AR o ofatumumabe vem sendo avaliado em pacientes com resposta inadequada ao metotrexate e ao anti-TNF-a em estudos fase II.

Epratuzumabe
O epratuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD22. O CD22 é uma glicoproteína de superfície restrita ao linfócito B que regula sua ativação e a interação com os linfócitos T. O CD22 é encontrado no citoplasma de linfócitos pró e pré-B, mas migra para a superfície do linfócito B maduro e desaparece quando este se diferencia em plasmócito.
O epratuzumabe vem sendo estudado no linfoma não Hodgkin em recidiva ou refratário ao tratamento convencional, incluindo rituximabe também vem sendo estudado no LES, na síndrome de Sjögren e na AR. Resultados preliminares têm demonstrado boa tolerabilidade e eficácia deste agente biológico.

Belimumabe
O belimumabe (LymphoStat-B) é um anticorpo monoclonal totalmente humano que reconhece especificamente e inibe a atividade biológica do BLyS (também conhecido como BAFF), que é uma molécula da superfamília TNF e atua na sobrevida, maturação e na ativação do linfócito B. Diversas células (monócitos, macrófagos, células estromais da medula óssea, sinoviócitos e astrócitos) produzem o BLyS, principalmente sob o estímulo do interferon g. Apesar do uso do belimumabe se associar à diminuição do número de linfócitos B circulantes, ele age apenas sobre o BLyS solúvel e não induz citotoxicidade. Estudos fase II com o uso de belimumabe estão em andamento em pacientes com LES e AR.

Atacicepte
O atacicepte (TACI-Ig) é uma proteína de fusão recombinante que simula o receptor solúvel (TACI) e bloqueia a ação de BLyS e de APRIL. Esse medicamento foi avaliado em estudo fase I no LES e foi observada boa segurança em diferentes doses aplicadas. Estudo fase II em pacientes com LES está em fase de recrutamento de pacientes. O atacicepte também vem sendo avaliado em estudo com pacientes com leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo e linfoma não Hodgkin.




Bibliografia
1. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology, 6a ed, Editora Saunders, 2007.
2. Arkfeld DG. The potential utility of B cell-directed biologic therapy in autoimmune diseases. Rheumatol Int 2008 28:205-15.
3. Dohner T, Kaufmann J, Wegener WA, Teoh N, Goldenberg DM, Burmester GR. Initial clinical trial of epratuzumabe (humanized anti-CD22 antibody) for immunotherapy of systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther 2006 8:R74-R85.
4. Edwards JC, Cambridge G. B-cell targeting in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. Nat Rev Immunol 2006 6:394-403.
5. Gray D, Gray M, Barr T. Innate responses of B cells. Eur J Immunol 200737(12):3304-10.
6. Kazkaz H, Isenberg D. Anti-B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases. Curr Opin Pharmacol 2004 4:398-402.
7. László M, Notarangelo LD. Immunological and genetic bases of new primary immunodeficiencies. Nature Rev. Immunology. 2007 7:851-861.
8. Mauri C, Ehrenstein MR. The 'short' history of regulatory B cells. Trends Immunol. 2008 29(1):34-40. Epub 2007.
9. Mizoguchi A, Mizoguchi E, Smith RN, Preffer FI, Bhan AK. Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice. J Exp Med. 1997 17 186(10):1749-56.
10. Smolen JS, Aletaha D, Koeller M, Weisman MH, Emery P. New Therapies for treatment of rheumatoid arthritis. Lancet 2007 370:1861-74.
11. Van Lochem EG, Van der Velden VHJ, Wind HK, Te Marvelde JG, Westerdaal NAC, Van Dongen JJM. Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow: Reference Patterns for Age-Related Changes And Disease-Induced Shifts. Cytometry - Part B (Clinical Cytometry). 2004 60B: 1-13.
12. Van Zelm M, et al. An antibody deficiency syndrome due to mutations in the CD19 gene. N. England J. Med. 2006 354:1901-1912.